Il Museo Diocesano di Velletri, erede e continuatore del Museo Capitolare costituito ed eretto dal Capitolo veliterno per volontà del vescovo cardinale Basilio Pompili nel 1927, ha trovato nuova e più consona sede nell'antico Seminario Vescovile: un prestigioso edificio secentesco il cui nucleo più antico risale alla seconda metà del XV secolo (che corrisponde all’attuale sala IV del percorso museale).
Il Museo Diocesano è stato riaperto al pubblico il 22 gennaio 2000, su iniziativa del vescovo Andrea Maria Erba.
Alle sei sale ricavate nel piano nobile del Seminario si accede dallo scalone seicentesco e la prima opera visibile al pubblico è l’affresco staccato della Crocifissione della scuola di Antoniazzo Romano.
Nella sala I è esposta la Croce Veliterna: l’opera fu un omaggio di Federico II a papa Alessandro IV, che, pur essendogli amico, non aveva in nulla ceduto alla politica del sovrano. Il papa in seguito donò la croce stauroteca, perché doveva contenere una reliquia della vera croce, alla cattedrale di Velletri.
Nella terza sala è collocata la tavola di Gentile da Fabriano della Madonna con Bambino, già in venerazione nella chiesa romana dedicata ai SS Cosma e Damiano, conservata fino agli inizi del XX secolo nella chiesa veliterna di S. Apollonia con il titolo di Madonna della Vita. L’opera è l’unica testimonianza rimasta del periodo romano dell’artista.
Il ricordo della committenza artistica dei frati Agostiniani di Lombardia insediati fin dalla fine del XIV secolo in Velletri nell'antica Abbazia benedettina di S. Maria dell'Orto è affidato ad un trittico di opere: quella che secondo la tradizione era conosciuta come la “Madonna di San Luca”, opera di un artista del periodo di transizione tra la tradizione bizantina e la nuova maniera giottesca, la grande Crocifissione, già citata, di scuola antoniazzesca ed Il Trasporto della Santa Casa di Loreto, unica opera firmata dal maestro romagnolo Giovan Battista Rositi e da lui dipinta nell'Anno Santo del 1500.
Tra le altre opere visibili nel museo citiamo: l'antica tavola del Salvator Mundi e le due Madonne con Bambino di Antoniazzo Romano, il busto seicentesco di San Clemente Papa realizzato da Giuliano Finelli, le grandi tele del XVII e XVIII secolo tra le quali spiccano la Madonna del Rosario di Sebastiano Conca e la Giuditta e Oloferne, copia coeva dell'opera di Guido Reni.
Dal 2001 il Museo Diocesano ospita la Mostra Orafa organizzata dal consorzio degli Orafi dei Castelli Romani riscuotendo un grande successo.